Dal taglia-incolla correttivo di specifiche sezioni difettose del DNA umano all’insorgere di nuove e pericolose imperfezioni genetiche, il passo può essere breve. Specie in presenza di malattie dal contesto genomico irregolare e complesso.
Le potenziali applicazioni in ambito diagnostico e terapeutico di quello che è il più recente degli strumenti di editing genomico, ossia CRISPR Cas9, dal 2012 – anno della sua scoperta – sono oggetto di continuo studio da parte della comunità scientifica internazionale, specie per quanto attiene alla correzione del difetto genetico alla base di alcune malattie rare, di malattie come distrofia muscolare e fibrosi cistica, di patologie neurologiche come Alzheimer e Parkinson e di alcune tipologie di tumori.
La sua peculiarità, rispetto alle tecniche di gene editing che lo hanno preceduto, sta nell’avere introdotto una semplificazione e una maggiore rapidità nelle operazioni di modifica del genoma, le quali – grazie a CRISPR Cas9 – prevedono individuazione e taglio della sequenza di DNA da correggere e incollaggio di quella nuova.
Takeaway
I rischi di CRISPR Cas9, il taglia-incolla genetico irreversibile
Si tratta di un taglia-incolla genetico che, però, fin da subito, ha mostrato i suoi rischi: la proteina Cas9 potrebbe, infatti, eseguire tagli fuori bersaglio definitivi e permanenti. Motivo per cui, in tutti questi anni, si è cercato di perfezionarne la tecnica, puntando – in particolare – alla reversibilità delle modifiche sul materiale genetico.
Dovendo fare un passo indietro e ricordare, in breve, che cosa si intende con l’acronimo universale CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, letteralmente “brevi ripetizioni palindromiche raggruppate e intervallate regolarmente”), diremmo che esso fa riferimento a una classe di segmenti di DNA presenti nei batteri, utili a tali microrganismi per individuare e fare a pezzi il genoma di virus simili a quelli che hanno prodotto le ripetizioni palindromiche. Insomma, CRISPR rappresenta, per i batteri, una naturale forma di protezione da attacchi esterni.
L’osservazione e lo studio di tale meccanismo di difesa hanno portato, negli anni, alla sperimentazione di tecniche di ingegneria genetica sempre più evolute, per la manipolazione del DNA negli organismi vegetali, animali e umani.
I primi lavori su quello che, solo in seguito, avrebbe assunto il nome di “CRISPR”, risalgono al 1987 e vedono protagonista l’Ateneo giapponese di Osaka. Ma l’acronimo vero e proprio venne coniato nel 2001, allo scopo di indicare in modo univoco le molteplici sequenze di DNA nei batteri, fino ad allora denominate con termini differenti nella letteratura scientifica.
Negli anni successivi, si arrivò alla scoperta, all’interno di una specifica tipologia di batterio detto “streptococcus pyogenes”, di un sistema CRISPR che si avvale della proteina Cas9, la cui funzione è, per l’appunto, quella di “forbice molecolare” a difesa dagli agenti patogeni.
Furono poi, nel 2012, le scienziate Emmanuelle Charpentier e Jennifer A. Doudna a consacrare tale sistema quale nuovo strumento capace di tagliare sequenze di DNA bersaglio all’interno del genoma di una cellula vegetale, animale e umana, eliminandole e sostituendole con altre.
Tuttavia, se CRISPR Cas9 è in grado di intervenire su specifiche sezioni difettose del genoma, purtroppo, «in determinate condizioni, la riparazione può portare a nuovi difetti genetici, come nel caso della malattia granulomatosa cronica».
A riferirlo, è un gruppo di scienziati della Division of Gene and Cell Therapy, presso l’Istituto di Medicina Rigenerativa dell’Università di Zurigo, in “Gene editing of NCF1 loci is associated with homologous recombination and chromosomal rearrangements” (Communications Biology, ottobre 2024). Vediamo di che cosa si tratta.
L’impatto delle forbici molecolari sulla Chronic Granulomatous Disease
La malattia granulomatosa cronica – nota anche come “Chronic Granulomatous Disease” (CGD) – è una malattia genetica rara ereditaria che colpisce circa una persona su 120.000. Il sistema immunitario di chi ne è affetto non è nelle condizioni di combattere ed eliminare dall’organismo alcuni tipi di batteri e di funghi. Per tale ragione, i pazienti sono soggetti a infezioni frequenti e talora pericolose per la loro vita [fonte: National Institute of Allergy and Infectious Diseases].
Sotto il profilo della sequenza del DNA – spiega il team di studio – «essa è causata dall‘assenza di due lettere del gene NCF1. Difetto genetico, questo, che comporta l’incapacità di produrre un complesso enzimatico che svolge un ruolo importante nella difesa immunitaria contro batteri e muffe».
Al centro del lavoro, l’impiego di CRISPR Cas9 al fine di tagliare la sequenza di DNA non corretta e inserire al suo interno le due lettere mancanti.
Nel dettaglio, l’esperimento è stato eseguito su colture di cellule immunitarie che presentavano lo stesso difetto genetico delle persone affette da malattia granulomatosa cronica.
Quello che è emerso durante l’esperimento in laboratorio è la presenza di nuovi difetti in alcune delle cellule riparate. Per la precisione, fanno notare gli autori, «mancano intere sezioni del cromosoma proprio nel punto in cui à avvenuto il taglia-incolla».
Il motivo è da ricercarsi nella particolarissima «costellazione genetica» del gene NCF1, «presente tre volte sullo stesso cromosoma: una volta come gene attivo e due volte sotto forma di pseudogeni, i quali hanno la stessa sequenza dell’NCF1 difettoso, ma normalmente non vengono utilizzati per formare il complesso enzimatico, in quanto privi di espressione all’interno della cellula» illustrano. Che cosa è accaduto, dunque?
I rischi di CRISPR Cas9 quando non distingue tra più versioni dello stesso gene da correggere
Tra i rischi derivanti dall’impiego delle forbici molecolari CRISPR Cas9 – evidenziano i ricercatori dell’Ateneo di Zurigo – quello del taglio accidentale del filamento di DNA in più punti del cromosoma, dovuto alla loro incapacità di distinguere fra le diverse versioni di un determinato gene (in questo caso specifico, l’NCF1):
«Quando le sezioni tagliate vengono successivamente riunite, interi segmenti di DNA potrebbero essere disallineati o mancanti. E le conseguenze sono imprevedibili. Nel peggiore dei casi, contribuiscono allo sviluppo di patologie afferenti all’area delle leucemie»
Ecco che, per ridurre al minimo gli impatti negativi, sono stati messi a punto alcuni approcci alternativi alla correzione del difetto genetico all’origine della Chronic Granulomatous Disease, comprese versioni modificate dei componenti del sistema CRISPR e l’integrazione di elementi protettivi capaci di ridurre la probabilità che le forbici genetiche taglino il cromosoma in più siti contemporaneamente. Ma nessuna di queste soluzioni si è dimostrata valida nel prevenire gli effetti collaterali del taglia-incolla genetico.
Più in particolare – precisa il gruppo di lavoro – per consentire l’identificazione puntuale delle mutazioni genetiche sulle quali intervenire, «abbiamo stabilito un metodo basato su ddPCR, per una quantificazione rapida e affidabile del gene NCF1 tra e intorno ai siti target». Dove, per “ddPCR” (acronimo di Droplet Digital PCR) si intende una tecnica di biologia molecolare atta a replicare in modo assai selettivo un segmento di DNA servendosi del metodo della suddivisione del campione in migliaia di goccioline (droplet), «consentendo, in questo modo, l’amplificazione delle molecole target in ogni singola gocciolina» [fonte: “Droplet-based digital PCR (ddPCR) and its applications” – TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2023].
Tuttavia, anche per quanto concerne tale soluzione, sebbene – riferisce il team – sia stata osservata «una modesta riduzione nell’incidenza delle alterazioni cromosomiche, la concomitante riduzione dell’efficienza dell’editing probabilmente, in futuro, ne potrebbe ostacolare la potenziale applicabilità clinica».
Glimpses of Futures
Lo studio descritto documenta una falla nelle terapie geniche basate sul CRISPR Cas9 e illustra i tentativi per sanarla, fornendo preziose informazioni per lo sviluppo di interventi di modifica genetica specifici per la malattia granulomatosa cronica. Certo, saranno necessari anni e anni di ricerca. Ma la linea direttrice è segnata.
Con l’obiettivo di anticipare possibili scenari futuri, proviamo ora ad analizzare – servendoci della matrice STEPS – gli impatti che l’evoluzione del corso di studi sui rischi del CRISPR Cas9 potrebbe avere sotto il profilo sociale, tecnologico, economico, politico e della sostenibilità.
S – SOCIAL: l’applicazione del sistema CRISPR Cas9 quale terapia nei casi di patologie i cui geni presentano un quadro complesso – dato da pseudogeni che fuorviano l’azione del taglia-incolla molecolare, come nella Chronic Granulomatous Disease – è messa in discussione dai riarrangiamenti cromosomici dovuti alla presenza di bersagli multipli. Il che ci mette di fronte a un bivio, che impone, da un lato, l’abbandono, in tali circostanze, dell’editing genomico in quanto portatore di ulteriori rischi per al salute dei pazienti e, dall’altro, la ricerca di una forbice genetica ad hoc per malattie come quella presa in esame dagli scienziati svizzeri. I risultati ottenuti dal lavoro illustrato vanno nella seconda direzione, suggerendo, per il futuro, la necessità di un’attenta valutazione del contesto genomico specifico (che escluda la presenza di regioni omologhe) e aprendo alla correzione dei difetti genetici all’origine di un più ampio parco di malattie rare.
T – TECHNOLOGICAL: nel corso degli ultimi anni, la scoperta di inediti sistemi CRISPR (uno studio del novembre 2023 – a cura del National Center for Biotechnology Information del National Institutes of Health USA, in collaborazione col McGovern Institute for Brain Research e il Broad Institute, entrambi in seno al Massachusetts Institute of Technology – ne ha addirittura identificati oltre cento) è un segnale, per il futuro, di tecnologie di taglia-incolla genetico sempre più precise, dai meccanismi di azione ancora più puntuali che, unitamente al progredire degli studi sui rischi del CRISPR cas9, annunciano uno scenario – da qui al prossimo ventennio – in cui il loro utilizzo potrebbe essere esteso a più tipologie di malattie genetiche.
E – ECONOMIC: in un ipotetico scenario futuro in cui, grazie all’evoluzione della tipologia di studi descritta, il sistema CRISPR Cas9 avrà superato tutti i propri limiti, diventando, di fatto, terapia per molte delle malattie di origine genetica, diverrà urgente, per i Governi di ogni paese, rivedere i tariffari della specialistica ambulatoriale, includendovi anche prestazioni tecnologicamente avanzate come quelle afferenti all’ingegneria genetica, purtroppo, oggi, in molti casi, ancora escluse e a totale carico delle famiglie, per le quali – secondo i dati di un’indagine sull’impatto economico delle malattie rare in paesi quali Germania, Francia e Italia, “Rare disease burden of care and the economic impact on citizens in Germany, France and Italy”, resa pubblica a fine ottobre 2023 – l’onere medio di costo è pari a 107.000 euro per paziente all’anno.
P – POLITICAL: dal punto di vista politico, in futuro, l’impatto maggiore dato da un sistema di editing genomico sempre più accurato ed efficiente, divenuto – a tendere – strumento terapeutico per le patologie genetiche, sarà comunque sempre correlato all’impegno – da parte di Governi e Istituzioni – teso alla salvaguardia della sicurezza, supervisionando gli effetti di CRISPR cas9 sullo stato di salute globale dei pazienti e monitorando costantemente i suoi eventuali rischi sul lungo periodo. La sicurezza per la salute umana dovrà sempre essere al centro degli obiettivi delle terapie geniche messe a punto mediante le forbici molecolari.
S – SUSTAINABILITY: con l’evoluzione delle tecnologie di editing genomico destinate all’ambito terapeutico, gli impatti sulla sostenibilità si traducono nell’importanza di garantire l’accesso a tutti alle terapie geniche, in linea con i principi di equità sanitaria e col diritto di un sostegno sociale fattivo per coloro che convivono con le malattie genetiche rare.
