Le luci (e qualche ombra) di quella che è la più recente tecnologia di editing genomico, capace di tagliare con precisione sequenze di DNA all’interno del genoma di una cellula animale, umana o vegetale, eliminandole e sostituendole con altre.

TAKEAWAY

• Originariamente scoperto nei batteri, il sistema CRISPR Cas9 si basa sull’impiego della proteina Cas9, capace di tagliare con precisione un DNA bersaglio all’interno del genoma di una cellula animale, umana o vegetale.
• La sua particolarità è data dall’avere introdotto una semplificazione – oltre che una maggiore precisione e una maggiore rapidità – nelle operazioni di manipolazione genetica: la proteina Cas9 taglia la sequenza di DNA individuata e incolla quella nuova.
• Un “taglia e incolla genetico” estremamente puntuale e mirato, che consente di intervenire addirittura sulle singole lettere del DNA, aprendo la strada a innumerevoli applicazioni su organismi animali e vegetali, nonché in ambito diagnostico e terapeutico. Ma non senza alcuni limiti e criticità.

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CRISPR Cas9: si chiama così il sistema di editing genomico valso alle scienziate Emmanuelle Charpentier e Jennifer A. Doudna, che lo hanno messo a punto, il Premio Nobel per la chimica del 2020.

Sistema che ha rivoluzionato la ricerca biomedica, introducendo per la prima volta, nell’ambito degli studi sul cancro, la possibilità di mettere a tacere un gene nella sua esatta posizione lungo la sequenza del DNA, consentendo così di modificare sia i meccanismi di controllo della sua attività, sia quelli di comunicazione del gene con l’ambiente circostante.

In particolare, in ambito clinico, la sua comparsa ha portato a ipotizzare il trattamento di tutta una serie di patologie a base genetica, per le quali, in passato, non era nemmeno immaginabile concepire un approccio terapeutico. Ma non solo.

Diffusasi, a partire dal 2012, nei laboratori di tutto il mondo, la tecnica alla base del CRISPR Cas9 è protagonista anche della ricerca sugli organismi animali e vegetali con, ad esempio, la creazione di piante e colture più resistenti agli agenti patogeni e alle diverse condizioni ambientali e climatiche e meno dipendenti da fertilizzanti chimici.

Ma andiamo in profondità, inquadrando il funzionamento, le applicazioni, gli aspetti critici di tale sistema e le prospettive di ricerca.

CRISPR Cas9: come funziona

Con l’espressione “editing genomico” si fa riferimento alla possibilità di modificare parti della sequenza del DNA di organismi animali o vegetali utilizzando tecniche diverse. Più nel dettaglio, le modifiche riguardano tagli nella sequenza del DNA, per poi eliminarne una parte, inserirne una nuova oppure sostituire porzioni di tale sequenza con altre.

Negli organismi più semplici quali batteri e lieviti, queste modifiche vengono praticate da decenni. Invece, per quanto riguarda i mammiferi – tra cui l’uomo – si sono diffuse (in via sperimentale, per motivi di studio e di ricerca) nell’ultimo ventennio, grazie all’avvento di tecnologie sempre più evolute.

Ciò che accomuna le recenti tecnologie di editing genomico, il fatto che, a una precisa proteina in grado di introdurre tagli nel DNA, viene associata una funzione di “selettore” molecolare capace di indicare “dove” esattamente tagliare.

La più recente di tali tecnologie è quella alla base del sistema CRISPR Cas9, acronimo di “Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-Cas9”, ovvero sequenze geniche che si ripetono a intervalli regolari, a cui sono associati dei geni Cas (Crispr associated) che codificano enzimi capaci di tagliare il DNA.

Originariamente scoperto nei batteri (per i quali svolge la funzione di “forbice molecolare”, aiutando questi microorganismi a proteggersi dai virus patogeni), il sistema si basa sull’impiego della proteina Cas9, capace di tagliare con precisione un DNA bersaglio all’interno del genoma di una cellula animale, umana o vegetale: il taglio viene eseguito in un punto specifico grazie all’utilizzo di una “guida”, ossia di una breve sequenza di RNA complementare al segmento del gene in questione, e permette di eliminare sequenze di DNA e di sostituirle con altre. Per sostituire una o più sequenze del DNA, bisogna fornire alla cellula una copia corretta del gene (che verrà utilizzata come stampo per la correzione) prodotta in laboratorio.

Verso la riduzione di errori e imprecisioni

In realtà, tutti i sistemi di editing genomico recenti sfruttano lo stesso meccanismo: guidare un enzima che taglia la doppia elica del DNA in un punto specifico del genoma e, quindi, inserire una nuova sequenza per effettuare la correzione.

La particolarità (e l’eccezionalità) del sistema CRISPR Cas9 è data dall’avere introdotto una semplificazione – oltre che una maggiore precisione e una maggiore rapidità – nelle operazioni di manipolazione. La proteina Cas9 taglia la sequenza individuata e incolla quella nuova.

Un “taglia e incolla genetico” estremamente puntuale e mirato, che consente di intervenire addirittura sulle singole lettere del DNA, aprendo la strada a innumerevoli applicazioni.

Ma nel 2017 la tecnica evolve e CRISPR Cas9, da sistema basato sul meccanismo taglia-incolla, diviene un “correttore” che non ha più bisogno delle forbici molecolari. Uno studio americano riportato su Nature rileva che è possibile correggere la sequenza bersaglio senza tagliare la doppia elica, dunque senza eventuali imprecisioni causate da meccanismi automatici di riparazione cellulare e riducendo al minimo gli errori. E la ricerca in questa direzione continua.

Un secondo studio del 2017 pubblicato su Science, invece, ha sperimentato una variante di Cas9 – ovvero Cas13 – per modificare a livello chimico una lettera sull’RNA messaggero (molecola che veicola le istruzioni contenute nel DNA) e non sul DNA. La novità di tale studio sta nel fatto che, agendo sull’RNA piuttosto che sul genoma, tutte le azioni di editing diventano reversibili.

E a ottobre del 2019 si inizia a parlare di una nuova tecnica, che vede imprecisioni ed errori ulteriormente ridotti. Dal Centro di ricerca biomedica e genomica di Cambridge, nel Massachusetts, proviene il meccanismo in base al quale la “guida” di RNA utilizzata del CRISPR Cas9 non solo indica il punto esatto nel quale effettuare la modifica, ma suggerisce anche quali sono gli errori da correggere, senza operare tagli né modifiche a livello chimico.

Il sistema di editing genomico, in questo caso, è fuso con un enzima specifico che si serve dell’RNA guida come “stampo”, ricopiandolo sotto forma di DNA e correggendo così la mutazione del gene di in modo molto più preciso.

CRISPR Cas9, applicazioni sugli organismi vegetali e animali

Come accennato, mediante la tecnica alla base del CRISPR Cas9, oggi è possibile intervenire all’interno del genoma di organismi vegetali, animali e umani.

In ambito vegetale, le modificazioni di parti della sequenza del DNA rendono molto più preciso e rapido lo sviluppo di varietà di piante agricole più resistenti agli agenti patogeni e alle diverse condizioni ambientali e climatiche, più produttive, più ricche di principi nutritivi e, dunque, in grado di nutrire una popolazione sempre più in crescita.

Servendosi del nuovo editing genomico, ad esempio, è stato possibile creare un particolare tipo di seme di cotone, privo di aldeide – sostanza tossica per l’uomo, che ha sempre impedito la commestibilità di questa pianta – e ricco di proteine e di fibre. E continuano le sperimentazioni per rendere la vite sempre più resistente alle infezioni fungine.

Sempre nell’ambito della ricerca sugli organismi vegetali, la modifica, per mezzo del sistema CRISPR, del genoma di una particolare microalga fino a raddoppiarne il contenuto lipidico, la rende una soluzione conveniente e sostenibile come possibile fonte di biocarburanti.

Un ulteriore vantaggio del sistema CRISPR sta nel fatto che – se con le tecniche di ingegneria genetica del passato era difficile ottenere più di una singola alterazione del genoma e, quindi, rendere una specie vegetale resistente a più di un agente patogeno o fattore ambientale – oggi si apre tutto un nuovo ventaglio di possibilità.

Relativamente agli organismi animali, al momento le principali applicazioni della proteina Cas9 sembrano essere quelle per l’introduzione di resistenze a malattie di origine virale attraverso la modificazione mirata di geni dell’animale.

Un’altra applicazione del metodo CRISPR lo vede al centro della generazione di fenomeni di “gene drive”, un meccanismo che tende a favorire la trasmissione di una determinata variante genetica all’interno di una specie vegetale o animale, in modo da rendere, in poche generazioni, una popolazione omogenea per la variante genetica selezionata.

Un esempio di gene drive viene da uno studio per il controllo della malaria, di cui si è parlato a maggio del 2020 in un articolo sulla rivista Nature Biotechnology: modificando il genoma delle zanzare che trasmettono il plasmodio della malaria, è possibile – in  base ai risultati di tale studio – fare nascere solo gli esemplari del sesso che non punge, facendo così collassare la riproduzione di popolazioni di insetti vettori della malattia.

Le potenziali applicazioni in ambito diagnostico e terapeutico

Dal 2012 – anno della sua scoperta – la comunità scientifica mondiale ha iniziato a studiare le potenziali applicazioni del CRISPR Cas9 in ambito medico (diagnostico e terapeutico), a cominciare dalle malattie genetiche quali distrofia muscolare e fibrosi cistica, dalle malattie neurologiche come Alzheimer e Parkinson, fino ad arrivare, anno dopo anno, alle malattie infettive come l’AIDS e a particolari tipologie di tumori.

A differenza delle applicazioni sugli organismi animali e vegetali, le pratiche dell’editing genomico sull’organismo umano sonno ancora agli albori e – come già detto – per la maggior parte si svolgono sul piano della ricerca e dello studio in laboratorio.

Quello che è chiaro è che, oggi, grazie alle tecniche del più recente sistema di editing genomico, si possono ricreare in vitro sistemi cellulari in grado di “mimare” alcune patologie, con l’obiettivo di identificare in modo più accurato e meticoloso nuove terapie. E in modo più rapido e semplice rispetto al passato.

Possiamo, inoltre, affermare che, allo stato attuale, CRISPR Cas9, permettendo di modificare il genoma di una cellula intervenendo direttamente sulla sequenza di DNA “malata”, rappresenta l’approccio più avanzato di terapia genica, senza (lo sottolineiamo per dovere di chiarezza) provocare alterazioni o inserire sequenze di DNA estraneo. Le nuove sequenze di DNA che vengono inserite – lo ricordiamo – sono date da copie corrette del gene prodotte in laboratorio.

In particolare, nella ricerca sul cancro, CRISPR Cas9 rappresenta uno strumento rivoluzionario. Innanzitutto, ha permesso di velocizzare l’intero processo attraverso il quale, in laboratorio, vengono studiate, su cellule animali, le mutazioni che portano alla malattia. Ma la scelta di usare questo strumento nella ricerca sul cancro è legata anche a questioni di precisione e di puntualità, che consentono di ricreare – in laboratorio e con buona approssimazione – le dinamiche proprie della patologia.

Nuove tipologie di applicazioni del sistema CRISPR Cas9

A luglio del 2022, un’azienda biotech americana (Verve Therapeutics) ha avviato la sperimentazione clinica sull’uomo di una terapia basata sul CRISPR Cas9, in grado di modificare il codice genetico del paziente per giungere a stabilizzare in modo permanente i suoi livelli di colesterolo nel sangue.

Questo studio – tuttora in corso – sposta per la prima volta il focus della terapia genica, concentrandosi su un’area di intervento che va oltre le malattie genetiche, le malattie rare e le patologie gravi, per aprire alla cura di disturbi comuni tra la popolazione, non necessariamente cronici, invalidanti o rischiosi per la vita del paziente, come lo è, appunto, l’ipercolesterolemia.

CRISPR Cas9 potrebbe, dunque, divenire una terapia per tutti, con incidenze sulla popolazione mondiale e raggiugere un numero altissimo di persone in tutto il mondo. In particolare, la tecnica utilizzata è CRISPR 2.0, basata sulla modifica di una singola lettera di DNA (in questo caso presente nelle cellule epatiche dei pazienti).

La sperimentazione si sta svolgendo in Nuova Zelanda, su gruppo di quaranta pazienti affetti da una forma ereditaria di ipercolesterolemia, che porta ad avere valori di colesterolo doppi rispetto alla media – anche durante l’infanzia – con elevato rischio di infarto in giovane età.

Il gene che il team di studio sta cercando di disattivare per mezzo di CRISPR 2.0 si chiama PCSK9, responsabile del mantenimento dei livelli di LDL- Low Density Lipoproteins, ovvero il colesterolo definito “cattivo”, perché, nel tempo, tende a depositarsi sulle pareti delle arterie.

Se i risultati finali dei test di sperimentazione daranno esito positivo – fa sapere il gruppo di ricerca – in futuro, la stessa metodologia potrebbe essere applicata anche studi per la riduzione dell’ipertensione o per la cura delle patologie metaboliche, tra cui il diabete.

Ma, a questo punto, si pone un interrogativo importante riguardo alle prospettive aperte da questa nuova tipologia di applicazioni del sistema di editing genomico CRISPR Cas9.

Probabilmente, dopo la cura definitiva dell’ipercolesterolemia, dell’ipertensione e del diabete, si passerà a ipotizzare terapie geniche a puro titolo preventivo, per persone del tutto sane, ad esempio per ridurre il rischio (non certo, ma solo eventuale) di future patologie.

Sotto il profilo etico, intervenire sul DNA di persone sane è corretto? È giusto che la terapia genica prenda il posto di normali ed efficaci terapie già esistenti sul mercato? Ricordiamo che stiamo parlando di un filone si ricerca nato con l’intento di studiare quelle malattie per le quali non esiste una cura.

Il CRISPR come futura terapia di massa, come terapia per tutti – compresi i sani – contiene in sé il rischio di diventare una moda, un puro esercizio di progresso scientifico.

I limiti di CRISPR Cas9 e le questioni bioetiche che solleva

Al di là delle potenzialità straordinarie di questo metodo e degli scenari inediti che apre soprattutto in ambito diagnostico e terapeutico, sul suo utilizzo – avverte la comunità scientifica – pesano alcune ombre che, ad oggi, frenano le sperimentazioni cliniche sull’uomo, sebbene queste inizino comunque a farsi sempre più spazio e a divenire più urgenti.

Sono soprattutto gli errori di taglio – detti anche off-target, “fuori bersaglio” – oltre ai dubbi su una possibile reazione immunitaria e sulla difficoltà nel riuscire a controllare al cento per cento l’effetto taglia-incolla, a fare sì che, ad oggi, CRISPR Cas9 sia utilizzato principalmente a scopo di ricerca su modelli animali e vegetali.

Il problema maggiore da affrontare riguarda il rischio che il sistema non riconosca le sequenze diverse da quella bersaglio e possa introdurre, durante le operazioni, cambiamenti non programmati e indesiderati nelle sequenze del DNA.

Benché rara, tra i limiti da considerare esiste anche la possibilità che il taglio introdotto venga riparato in maniera non corretta, causando così ulteriori mutazioni del gene. Come si è accennato in precedenza, la ricerca sta lavorando al superamento di tali limiti e lascia ben sperare nella loro soluzione negli anni a venire.

Un altro aspetto da considerare concerne l’applicazione dell’editing genomico alle cellule germinali prima della nascita, arrivando a correggere gli embrioni umani. Quello che è importante sottolineare è il fatto che, allo stato attuale delle conoscenze, gli interventi sulle cellule germinali sono considerati “eticamente irresponsabili”.

Tuttavia, questa posizione non esclude che, in futuro, previa istituzione di procedure di supervisione a livello nazionale e internazionale, e con l’applicazione di misure di sicurezza tali da ridurre al minimo ogni possibile rischio, il sistema CRISPR Cas9 su embrioni umani possa essere considerato legittimo dal punto di vista etico, nel caso in cui si intervenga per eliminare alcune malattie ereditarie o per ridurre i rischi associati a specifiche patologie.

Arricchire la cassetta degli attrezzi e sfidare limiti e criticità: dove spinge la ricerca

Nei laboratori di ricerca, il lavoro non si ferma. La scienza punta a migliorare, affinare, implementare il sistema CRISPR, in un processo di evoluzione continua.

Due esempi provengono dagli Stati Uniti, dove, lo scorso luglio, l’American Association for the Advancement of Science ha annunciato la scoperta dell’enzima CRISPR ipercompatto, presente solo in enormi batteriofagi e noto come CRISPR-CasΦ, in grado di indirizzare una gamma più ampia di sequenze genetiche rispetto alla versioni Cas9 e Cas12.

Quali capacità possiede questa nuova versione del sistema, tuttora allo studio? Gli autori hanno testato le sue capacità di espansione del bersaglio, sia nelle cellule umane che in quelle vegetali. Date le sue piccole dimensioni, CasΦ potrebbe offrire nuovi vantaggi per la consegna cellulare rispetto ad altre proteine CRISPR-Cas.

La seconda ricerca – di cui si è data notizia a febbraio 2021 su The CRISPR Journal – è frutto del lavoro degli scienziati del Gene Editing Institute di ChristianaCare, nella Carolina del Nord, i quali hanno sviluppato un’app capace di identificare potenziali errori non intenzionali nell’utilizzo del metodo CRISPR. Spiega Eric Kmiec, direttore del Gene Editing Institute e autore principale dello studio:

“La nostra ricerca dimostra che quando CRISPR viene utilizzato per riparare un gene, esiste il rischio che introduca una varietà di sottili cambiamenti nel DNA che si trova nei pressi del sito in cui avviene la riparazione. Tali cambiamenti possono essere innocui, ma i ricercatori devono poter determinare se questi sono in grado di interrompere la riparazione stessa oppure alterare la funzione del gene in modo tale da danneggiare il paziente”

Inoltre, l’app – chiamata DECODR (DEconvolution of COmplex Dna Repair) – potrebbe rappresentare uno strumento utile anche per valutare se le riparazioni del gene producono risultati diversi da paziente a paziente, compromettendone in questo modo la sicurezza e l’efficacia.