Un recente studio, avvalendosi di un inedito metodo di prime editing, rende disponibile un insieme di strumenti sperimentali e computazionali con i quali generare e studiare da vicino le alterazioni genetiche delle cellule tumorali.
Trattare di varianti genetiche patogene significa fare riferimento a un’area di studi assai ampia e complessa, in cui le alterazioni in centinaia di geni diversi, innescate da una determinata patologia, possono, a loro volta, dare origine, in ognuno dei geni coinvolti, a differenti modalità di mutazioni, dove «alcune vanno solo a sostituire un nucleotide del DNA, mentre altre vi inseriscono o cancellano intere sezioni» [fonte: Mutation, Repair and Recombination – National Library of Medicine].
In un articolo reso pubblico su Nature Biotechnology il 12 marzo 2024 – “High-throughput evaluation of genetic variants with prime editing sensor libraries“ – a cura del Department of Biology del Massachusetts Institute of Technology (MIT), gli autori, a proposito dei genomi tumorali, spiegano come questi contengano «un repertorio di varianti a singolo nucleotide e alterazioni del numero di copie su larga scala, che possono avere un impatto su molti geni in modi diversi, a seconda del tipo di alterazione, della funzione genetica e del contesto biologico». E, rimarcando come il profilo genetico del tumore sia un fattore noto nell’ambito dell’esordio e della progressione della malattia, nonché della risposta di quest’ultima al piano terapeutico, fanno notare che la zona d’ombra, tuttora, riguarda l’impatto che le migliaia di mutazioni osservate nelle cellule tumorali hanno sul comportamento dei geni e delle proteine. Analizzare questo impatto sarebbe, in futuro, l’ennesimo, importante, passo avanti verso la personalizzazione delle terapie oncologiche, specie di quelle destinate a pazienti colpiti da tumori «che presentano lesioni genetiche specifiche».
Takeaway
Prime editing: cos’è e perché si distingue dal sistema CRISPR Cas9
Il gruppo di studio del Massachusetts Institute of Technology ha individuato nel prime editing lo strumento più idoneo a generare e modellare – per poi studiarle e valutarle – le varianti genetiche dei genomi tumorali (a partire dalla più piccola) nel loro contesto genomico nativo. L’obiettivo è arrivare a comprendere – nel loro stesso ambiente biologico – la loro incidenza sullo sviluppo del tumore e, soprattutto, sulle reazioni al suo trattamento. Ma prima di approfondire il tema, soffermiamoci su alcune definizioni.
Il prime editing è una tecnica di editing genomico basata sul sistema CRISPR (diffusosi nei laboratori di tutto il mondo a partire dal 2012), dunque in grado di modificare sequenze di DNA bersaglio all’interno del genoma di una cellula vegetale, animale e umana, ma con maggiore controllo e precisione rispetto ad altri metodi,evitando il rischio degli effetti “fuori bersaglio”, ossia le modifiche indesiderate.
A parlarne per la prima volta, un team di ricercatori del Merkin Institute of Transformative Technologies in Healthcare, in seno al Broad Institute di Harvard, tra cui anche David R. Liu, membro del medesimo gruppo di lavoro del MIT. In un articolo apparso su Nature il 21 ottobre 2019 – “Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA” – il team descrive il meccanismo del prime editing, sottolineando che, a differenza del CRISPR Cas9, non opera tagli alla doppia elica del DNA e, per intervenire nel punto esatto della modifica, utilizza l’RNA guida.
In un lavoro più recente, pubblicato sul numero di agosto 2023 della rivista scientifica Trends in Biotechnology – “Prime editing: advances and therapeutic applications” – viene definito come una tecnica «“cerca e sostituisci” che introduce tutte le conversioni da base a base, compresi piccoli inserimenti ed eliminazioni, senza la necessità di rotture del doppio filamento».
Generare varianti genetiche nel loro ambiente biologico
Lo stesso David R. Liu, oggi, del prime editing mette in evidenza la sua capacità di rispondere a quella che è ritenuta una delle maggiori sfide poste dall’editing genomico basato sul CRISPR, ovvero consentire agli scienziati di «generare qualsiasi tipo di variante genetica nel suo ambiente naturale».
Riferito ai genomi delle cellule tumorali, però, questo traguardo ha richiesto lo sviluppo di una tecnica ad hoc a sostegno del sistema di editing, per renderlo ancora più preciso e affidabile.
Gli RNA guida (denominati “pegRNA”) utilizzati dal prime editing per indirizzare gli enzimi CRISPR nel punto esatto della sequenza di DNA in cui tagliare, sono connottati da diversi livelli di efficienza, responsabili di una certa “variabilità” (in gergo “rumore”) nei dati dei pegRNA che non generano la modifica corretta, come illustrano gli autori:
«Una limitazione all’utilizzo del prime editing per indagare sistematicamente le varianti genetiche è la variabilità intrinseca nell’efficienza dell’editing tra diversi pegRNA. In passato, sono stati sviluppati numerosi strumenti computazionali per la progettazione dei pegRNA, inclusi algoritmi di apprendimento automatico in grado di creare insiemi di RNA guida per produrre modifiche ad alta efficienza. Tuttavia, anche i pegRNA generati da questi algoritmi predittivi richiedono un’ampia validazione sperimentale e non è garantito che la loro attività di modifica sia fortemente correlata tra i diversi tipi di cellule»
Ecco che, per ridurre tale variabilità intrinseca, il team ha messo a punto un metodo che si serve di “siti bersaglio sintetici”, in grado di supportarlo nel calcolo del grado di efficienza di ciascun RNA guida testato.
In breve sintesi, determinando la percentuale di volte in cui ogni pegRNA utilizzato dal sistema introduce la modifica corretta nei siti bersaglio sintetici, l’inedita tecnica ha permesso ai ricercatori di ottenere una misurazione empirica dell’efficienza di ogni pegRNA.
Analisi delle varianti genetiche delle cellule tumorali: focus sul gene TP53
La sperimentazione della nuova tecnica di prime editing si è focalizzata, in particolare, su un gene specifico, il TP53, noto per le sue varianti genetiche in più della metà dei pazienti colpiti da cancro. Varianti che, tuttavia – puntualizza il gruppo di ricerca -rimangono per la maggior parte inesplorate.
Più nel dettaglio, sono state esaminate cellule di adenocarcinoma polmonare umano con più di mille diverse alterazioni del gene in questione. Le mutazioni introdotte, per mezzo della nuova metodologia, dagli autori dello studio, sono state seguite dalla misurazione dei tassi di sopravvivenza delle cellule malate, valutando l’impatto di ciascuna mutazione sulla forma cellulare.
Quello che emerso da questo primo esperimento è una differenza sostanziale tra i risultati ottenuti dal team del MIT e quelli che risalgono a ricerche precedenti, realizzate con tecniche di editing genomico «che prevedono l’inserimento, all’interno della cellula malata, di copie artificiali del gene TP53 mutato».
In pratica, si è osservato che le mutazioni introdotte col nuovo approccio al prime editing, pur impedendo alla proteina tumorale p53 di formare un insieme di quattro proteine (detto “tetramero”), hanno comunque consentito alle cellule tumorali di sopravvivere, mentre gli studi passati sono giunti a conclusioni opposte, classificando quelle stesse mutazioni come “benigne”.
Questo è un caso emblematico – concludono i ricercatori – in cui il profilo genetico di cellule tumorali ottenuto attraverso varianti indotte, generate in laboratorio, è osservabile solo se tali varianti vengono progettate e modellate nel loro contesto genomico nativo e non mediante sistemi artificiali.
Glimpses of Futures
Seppure la sperimentazione è agli esordi, gli autori guardano alla futura applicazione della loro tecnica di prime editing allo studio delle varianti genetiche osservate in altri geni correlati a patologie oncologiche. L’obiettivo principe è duplice: riuscire a definire terapie “su misura” del paziente, formulate per curare le specifiche mutazioni di quel determinato gene e prevedere come il tumore del singolo potrebbe rispondere a un particolare trattamento farmacologico.
Utilizzando la matrice STEPS, proviamo ora ad anticipare possibili scenari futuri, analizzando gli impatti che l’evoluzione della nuova tecnica di prime editing per la generazione, la modellazione e l’analisi delle varianti genetiche dei genomi tumorali nel loro contesto nativo potrebbe avere dal punto di vista sociale, tecnologico, economico, politico e della sostenibilità.
S – SOCIAL: l’approccio seguito dal Massachusetts Institute of Technology va nella direzione dell’ampliamento delle conoscenze del complesso mondo delle varianti genetiche patogene, proponendosi – in uno scenario futuro – di giungere a sviluppare terapie sempre più personalizzate e mai standard. Più in particolare, in ambito oncologico, il fatto di poter generare, nel loro ambiente biologico – grazie all’editing genomico – precise varianti genetiche di un dato genoma tumorale, per capire se queste uccidono le cellule malate oppure se le lasciano libere di riprodursi, apre prospettive di ampia portata, in cui il paziente, con le sue caratteristiche uniche e il suo profilo genetico personalissimo, è al centro assoluto della scena terapeutica.
T – TECHNOLOGICAL: in futuro – anticipa il team di studio – la tecnica dei “siti bersaglio sintetici”, con cui misurare il livello di efficienza degli RNA guida utilizzati dal sistema di prime editing e ridurre, così, la sua variabilità intrinseca, potrebbe, ad esempio, essere impiegata per studiare l’incidenza delle varianti genetiche endogene sulla resistenza ai farmaci o su altri fenotipi cellulari rilevanti per il cancro. Inoltre, si potrebbero sviluppare ulteriori metodi per fare fronte alla variabilità intrinseca nell’efficienza dell’editing e renderlo uno strumento ancora più affidabile nell’indagare le varianti genetiche.
E – ECONOMIC: sotto il profilo economico, l’aspetto più critico di una futura, possibile, adozione della nuova tecnica di prime editing per indurre (e studiare) le varianti genetiche delle cellule tumorali nel loro contesto genomico, è relativo ai costi, tuttora elevati per quanto concerne tutte le operazioni inerenti alla genetica e non sostenuti dal nostro Sistema Sanitario Nazionale. A tale riguardo, a partire da gennaio 2024, è entrato in vigore il nuovo tariffario della specialistica ambulatoriale, che però non vede ancora inserite molte prestazioni di genetica medica, tra cui anche quelle per la diagnosi precoce delle malattie rare. Questo rimane un grosso nodo da sciogliere, se si intende tenere il passo con la ricerca scientifica e le sue scoperte a vantaggio del benessere e della salute umana.
P – POLITICAL: dal punto di vista politico, l’impatto di una futura evoluzione della nuova tecnica di prime editing per la generazione e l’analisi delle varianti genetiche dei genomi tumorali nel loro ambiente naturale, dovrà necessariamente passare attraverso una politica che sposi il regime di esenzione per le prestazioni mediche di natura genetica, oggi – come accennato – nel nostro Paese ancora escluse dal tariffario della specialistica ambulatoriale.
S – SUSTAINABILITY: in un eventuale scenario futuro ancora segnato dall’assenza di sostegno economico da parte del Sistema Sanitario Nazionale in caso di spese oncologiche che prevedano il ricorso a sistemi di editing genomico per la ricerca di terapie personalizzate, la collettività dovrà comunque fare i conti con l’imperativo morale, proprio di ogni Paese democratico, che impone di supportare le persone più fragili sotto il profilo economico e sociale, specie in caso di difficolta e disagio di natura fisica e/o psicologica.
