CRISPR Cas9, prosegue la ricerca di tecniche alternative per superarne i limiti

Tra le tecniche di gene editing alternative al CRISPR Cas9, anche quella della ricombinazione genetica, in grado di eseguire il “taglia e cuci genetico” senza spezzare il DNA.

TAKEAWAY

  • Il sistema di editing genomico CRISPR Cas9 ha, fin dai suoi esordi, mostrato dei limiti, tra cui il rischio di intervenire con tagli “fuori bersaglio” in modo definitivo e permanente.
  • Ecco perché, fin dalla sua scoperta, si è cercato di perfezionarne la tecnica, puntando, in particolare, alla reversibilità delle modifiche effettuate sul materiale genetico.
  • Tra le tecniche alternative più recenti, uno strumento chiamato Retron Library Recombineering (RLR), basato sul metodo della ricombinazione genetica e in grado di operare mutazioni nel genoma senza spezzare il DNA.

La ricerca di tecniche alternative al CRISPR Cas9 non si arresta. Dal momento in cui ha visto la luce, nel 2012, per mano delle scienziate Emmanuelle Charpentier e Jennifer A. Doudna, ha rivoluzionato la ricerca in ambito biomedico, oltre che nell’ambito degli studi sugli organismi animali e vegetali.

La sua particolarità, rispetto alle tecniche di gene editing che lo hanno preceduto, è l’avere introdotto una semplificazione, una maggiore precisione e rapidità nelle operazioni di modifica del genoma: è in grado di individuare e tagliare la specifica sequenza di DNA da correggere e di incollare quella nuova.

Un “taglia e incolla genetico”, dunque. Che, fin da subito, però, ha mostrato i suoi limiti: la proteina Cas9 potrebbe intervenire con tagli “fuori bersaglio”. E le mutazioni che effettua sono definitive e permanenti.

Ecco perché, fin dagli anni successivi alla sua scoperta, si è cercato di perfezionarne la tecnica, puntando – in particolare – alla reversibilità delle modifiche effettuate sul materiale genetico.

In tema di tecniche alternative al CRISPR Cas9, nel 2017, uno studio pubblicato su Science sperimenta una variante di Cas9 – detta Cas13 – per modificare una lettera sull’RNA messaggero (molecola che veicola le istruzioni contenute nel DNA) e non sul DNA. La novità sta nel fatto che, agendo sull’RNA piuttosto che sul genoma, tutte le azioni di editing diventano reversibili.

E a ottobre del 2019, un’altra tecnica – messa a punto dal Centro di ricerca biomedica e genomica di Cambridge – riduce ulteriormente imprecisioni ed errori, fondendo il sistema di editing con un enzima specifico che si serve dell’RNA guida come “stampo”, ricopiandolo sotto forma di DNA e correggendo così la mutazione del gene in modo molto più preciso.

Più recentemente, in un documento pubblicato sulla rivista scientifica Cell il 9 aprile 2021, un team di ricercatori descrive una nuova tecnica di editing genomico denominata CRISPRoff, che consente di controllare l’espressione genica con elevata specificità, lasciando invariata la sequenza del DNA. E la ricerca di alternative prosegue.

Tecniche alternative al CRISPR Cas9: da Harvard un nuovo strumento chiamato Retron Library Recombineering (RLR)

Tra le tecniche alternative al CRISPR Cas9, anche quella della ricombinazione genetica, in grado di eseguire il “taglia e cuci genetico” introducendo un “pezzo” di DNA alternativo nel momento stesso in cui la cellula sta replicando il suo genoma, creando così mutazioni genetiche senza rompere il DNA.

Questo metodo può essere utilizzato su molte cellule contemporaneamente, creando così “pool” di mutazioni. Tuttavia, comprendere a fondo quali sono gli effetti di tali mutazioni richiede che ogni gene mutante venga isolato, sequenziato e caratterizzato. Compito, questo, che necessita di molto tempo.

Dal Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering dell’Università di Harvard e dall’Harvard Medical School (HMS) proviene un nuovo strumento di editing genomico chiamato Retron Library Recombineering (RLR) che semplifica i passaggi descritti, generando – spiegano gli scienziati che lo hanno messo a punto – milioni di mutazioni genetiche simultaneamente e codificando le cellule mutanti, in modo che l’intero pool di mutazioni possa essere sottoposto a screening in una sola volta.

Più nel dettaglio, tale strumento poggia sui “retroni” (Retron), ossia elementi genetici presenti nei batteri, ai quali i ricercatori hanno iniziato a interessarsi solo negli ultimi anni. E lo hanno fatto perché – esattamente come è accaduto per il CRSPR Cas9, originariamente scoperto nei batteri – hanno intuito che potevano essere utilizzati per l’editing genomico su batteri appunto, lieviti e persino su cellule umane.

tecniche alternative al CRISPR Cas9
Rispetto alle tecniche di gene editing che lo hanno preceduto, il CRISPR Cas9 è in grado di individuare e tagliare la specifica sequenza di DNA da correggere e di incollare quella nuova. Tra i suoi limiti, però, il rischio di intervenire con tagli “fuori bersaglio”, oltre a operare sul materiale genetico in modo definitivo e permanente.

La costruzione di una libreria di geni mutanti, cuore del sistema RLR

Per verificare se si potessero effettivamente utilizzare i retroni per ottenere una ricombinazione genetica efficiente – e che potesse rientrare tra le tecniche alternative al CRISPR Cas9 – il team di studio ha dapprima creato piccoli filamenti circolari di DNA batterico contenenti geni di resistenza agli antibiotici.

La sequenza di retroni è stata, quindi, inserita nei batteri di Escherichia coli. Ma, inizialmente, meno dello 0,1% di E. coli incorporava la mutazione desiderata.

Per migliorare tale prestazione iniziale, il team ha apportato diverse modifiche genetiche ai batteri. In primo luogo, ha disattivato il meccanismo di riparazione del “disadattamento naturale delle cellule”, che corregge gli errori di replicazione del DNA. Cambiamento – questo – che ha elevato la percentuale di batteri in grado di incorporare la sequenza di retroni.

Dopo una serie di passaggi, il gruppo di ricercatori ha sminuzzato il genoma di un ceppo di E. coli altamente resistente a un altro tipo di antibiotico e ha utilizzato questi frammenti per costruire una libreria (una mappatura) di decine di milioni di sequenze genetiche contenute all’interno delle sequenze dei retroni.Spiega George Church, tra gli autori dello studio e professore di genetica presso l’Harvard Medical School:

Le librerie di geni mutanti, ottenute grazie al sistema Retron Library Recombineering, ci permette di osservare gli effetti delle mutazioni nel genoma, nonché il modo in cui tali mutazioni sono in grado di interagire tra loro

Resta ancora molto lavoro da fare per perfezionare tale strumento, conclude. In primis, c’è da migliorare i tempi di modifica. Rispetto al CRISPR Cas9, però, la maggiore semplicità e la reversibilità del sistema RLR potrebbe, nel tempo, aiutarci ad approfondire lo studio in merito a come più mutazioni genetiche interagiscono tra loro.

Il che porterebbe alla produzione di una vasta mole di dati che, opportunamente analizzati da un sistema di intelligenza artificiale, condurrebbero ad analisi predittive circa ulteriori effetti mutazionali.

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Paola Cozzi
Giornalista dal solido background acquisito lavorando presso i più prestigiosi Editori italiani | Ventidue anni di esperienza nello sviluppo di prodotti editoriali b2b, cartacei e digitali | Vent'anni alla direzione di una testata b2b in tema di Sicurezza anticrimine di tipo fisico | Attualmente si dedica al Giornalismo Digitale ed esplora nuove tecniche e nuovi stili di comunicazione
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